近些年董常生教授带领的科研团队取得的部分科研成果展示

1. 羊驼胚胎移植研究有了新的突破.

2. 羊驼皮肤cDNA文库规模测序完成,共向Genebank提交7286条序列,该文库命名为CDSA.

3. 羊驼毛色基因功能研究平台得到进一步提高.

4.羊驼皮肤MicroRNA芯片已制备,发现了不同毛色皮肤中差异表达的MicroRNA

◇ 羊驼的胚胎移植技术 

        羊驼胚胎移植技术是通过人为方式对具有优良遗传特性、高产性能和优秀体格外貌的羊驼进行技术处理，产生多于正常数倍的胚胎（受精卵），将胚胎取出移植到其他母羊驼子宫内，同时生产出多个优秀个体的一项高新技术。此外，其还包括体外受精、核移植、胚胎分割、性别鉴定等应用新技术。实施胚胎移植技术，有利于加快良种羊驼的扩繁步伐，缩短羊驼的育种间隔周期，改善羊驼种群质量，保存羊驼优良的种质资源，实现较好的经济效益。 目前羊驼胚胎移植技术的研究在美国密歇根大学George教授的指导下进展十分顺利。在不久的将来，我们就可以看到有很多新生命的诞生。

        干细胞是指具有自我更新能力并且经过数次分裂分化后能产生一种或一种以上子代成熟细胞的细胞群，可分化为胚胎干细胞和成体干细胞、其他细胞、组织及器官，胚胎干细胞是最有应用价值的干细胞，但由于来源于胚胎，进行相关研究和治疗必然涉及伦理和道德问题,所以胚胎干细胞的研究受到限制，而来源于同体的成体干细胞就不存在这种限制。皮肤组织更新速度快、再生能力强，因此，来自皮肤局部的干细胞受到了重视。毛囊干细胞在体外可诱导分化为神经元细胞，神经胶质细胞，角化细胞，平滑肌细胞和黑色素细胞等，而在体内（移植后）可分化为神经元、黑色素细胞等。研究表明，毛囊干细胞(hair follicle stem cells,FSC)能分化成毛囊、皮脂腺、表皮，对毛发的再生以及毛色的影响起着重要的作用，已成为目前的研究热点。因此研究毛囊干细胞分离方法、如何增殖与分化及其调控机制对于实现毛发和皮肤颜色、毛发再生和促进皮肤损伤后功能与结构的完全修复意义重大。现就毛囊干细胞的研究进展综述如下。
    1.  毛囊干细胞的特性 
       ① 毛囊干细胞的定位
       最初，人们在毛球部发现有显著细胞分裂现象，认为毛球部是细胞分裂及毛囊长期起始的重要部位。目前普遍认为毛囊干细胞定位于毛囊的隆突区。Cotsarelis等1990年通过3H-TdR对小鼠皮肤进行标记，4周后发现毛母质细胞不含有标记而95%以上的毛囊隆突部细胞仍保持标记。Taylor等使用了一种双标的方法追踪毛囊干细胞。用BrdU和3H分别在不同时期标记小鼠表皮增殖细胞，后发现双标细胞不仅迁移出现在向下生长的毛囊细胞群中，同时也迁移至毛囊隆突区，通过对嵌合小鼠的观察发现，供体区特征性标记物表达逐渐出现在毛囊周围，包括表皮、皮腺以及毛囊自身的结构中，从而进一步证实了毛囊干细胞的迁移规律。
      另外，毛囊干细胞定位于隆突部还有以下合理性：①隆突部位于毛囊恒定部的最下端，不同于毛球部，随毛囊周期不同存在周期性退化；而且作为毛囊恒定部的最低点，隆突部细胞能够与退化期上移的毛乳头密切接触，相互作用，诱导出下一轮的毛发周期。移植研究证实，没有毛乳头存在，新一轮的毛发周期是不可能开始的；②隆突部是一个突出点，当拔毛时它是安全的，而毛球部在拔毛时则容易受到损伤。③隆突部血管丰富并有神经分布。
       ② 毛囊干细胞的表面标记
       体内通过标记滞留法，离体细胞培养通过克隆形成能力可鉴定毛囊干细胞，用这两种方法分离毛囊干细胞却非易事。因此有必要利用毛囊干细胞特异性毛囊干细胞特异性标记，潜在的相对特异性毛囊干细胞特异性标记主要包括：B1整合素，a6整合素，角蛋白（Keratin）K15、K19，CD71（转铁蛋白受体），转录因子p63及CD34。
       ③ 干细胞分化调控
       干细胞具有多向分化潜能，周边微环境对其增殖、分化有重要作用。成体组织干细胞具有“可塑性（plasticity）”、“横向分化（trans-differentiation）”或“跨系分化”的潜能。体外，低传代培养的毛乳头细胞可诱导毛囊上皮细胞形成毛囊样结构。Taylor，Oshima等人证实毛囊干细胞聚集此处不仅具有巨大的增殖潜能，而且能上下迁移，参与表皮、毛囊和皮脂腺的形成。而当外伤原因使表皮缺损情况下，周边毛囊可再生出新的表皮。Lako等研究发现，皮肤中的毛囊干细胞在体外能分化为血细胞，将其移植到小鼠体内后，发现毛囊干细胞可重建受体小鼠的血液系统。
       另外，毛囊干细胞具有转分化潜能，可诱导分化为角膜上皮细胞。角膜上皮大面积缺损需进行临床角膜移植，但目前移植又存在来源不足、免疫排斥等诸多问题。姜自玲，杨力等采用角膜缘的组织液对毛囊干细胞进行诱导培养，10天后可见诱导培养的部分毛囊干细胞阳性表达角膜上皮细胞特异性因子角蛋白K12，说明该部分毛囊干细胞在诱导培养过程中已成功地转分化为角膜上皮样细胞。
   2.  毛囊干细胞的应用
       ① 毛发再生 2004年，Fuch等通过转基因鼠分离毛囊干细胞并接种到裸鼠上长出毛发的试验，为斑秃、斑痕性秃发患者带来了希望，毛囊干细胞的研究将会使毛发的原位再生和体外重建成为可能。
       ② 创面愈合 研究表明，当皮肤发生重度烧伤时，表皮和真皮全层被破坏，用现有的组织工程皮肤覆盖创面，可以起到皮肤屏障的作用，但不具备正常皮肤的生理功能，不能生成毛囊、汗腺等皮肤附属器官，严重影响了患者的生活质量。利用毛囊干细胞具有向皮肤方向分化的特性，作为人工皮肤中表皮细胞来源，毛囊真皮细胞为真皮等物的细胞来源，构建出具有毛囊、汗腺等皮肤附属结构的组织工程皮肤。因而应用干细胞的无限增殖和多向分化潜能对今后进行表皮重建将具有重大实用价值。
       ③ 决定动物皮毛的颜色 毛囊干细胞可诱导分化为表皮、毛发、黑色素及黑素细胞，从而决定皮毛的颜色。
       ④ 基因程序重调 利用毛囊干细胞等成体细胞使其逆程序化形成胚胎干细胞，避免了伦理和道德方面的限制，有利于临床上的广泛应用。2006年，日本京都大学的Takah ashi及Yamanaka在诱导体细胞再程序化为胚胎干细胞方面获得了重大突破。Yamanaka研究小组证明了iPS细胞不仅能分化成为小鼠多种组织类型细胞，同时能参与嵌合体小鼠的生成，而后者正是干细胞多分化潜能鉴定的标准。他们的后续研究，充分证明了iPS细胞的多潜能性。
       ⑤ 其它 毛囊干细胞的体外培养既能模拟器官的发育过程又能排除一些体内因素的干扰，是筛选治疗毛发相关疾病的极好模型. 利用毛囊干细胞、毛乳头细胞、真皮鞘细胞等细胞体外重建毛囊器官，为药物筛选、皮肤肿瘤的研究提供很好的模型。研究毛囊干细胞的增殖分化过程还有助于进一步阐明毛源性皮肤肿瘤的发生机制，有助于研究毛发生长周期中的信号转导等调控机制。
       总之，干细胞的研究正成为目前组织工程研究领域的热点，随着科技水平的提高，人们一定会在此领域获得重大突破。
   3 . 展望
       表皮干细胞具有无限增殖和多向分化潜能对今后进行表皮重建将具有重大实用价值, 调控表皮干细胞直接分化为毛囊、汗腺等皮肤附属组织 , 实现皮肤烧伤创面从解剖修复到功能修复。此外 ,干细胞已经成为转基因的重要靶细胞 , 在基因治疗和组织器官再造的组织工程中有广阔的应用前景。随着科技的进步 , 干细胞与端粒酶活性等的深入研究 , 干细胞的研究在生命科学领域将具有深远意义。
另外，体细胞再程序化的研究成果无疑为干细胞提供了更加可行、更为广阔的应用前景。采用这项技术，可将患者自身的体细胞经诱导去分化为iPS细胞，后者再经诱导分化为所需组织类型的细胞，然后用于细胞移植治疗某些疾病。这不但解决了人类干细胞在临床应用中来源有限的问题，同时，采用患者自身的iPS细胞进行移植治疗，还可避免机体产生免疫排斥等不良反应。但就目前而言，这项技术仍处于起步阶段。相信在广大科研人员的不懈努力下，这项技术必将造福于人类。

◇ 显微操作技术概论     

         显微注射法（microinjection）是利用管尖极细（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射针，将外源基因片段直接注射到原核期胚或培养的细胞中，然后藉由宿主基因组序列可能发生的重组（rearrangement）、缺失（deletion）、复制（duplication）或易位（translocation）等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内。

       这种显微注射术的程序，需有相当精密的显微操作设备，制造长管尖时，需用微量吸管拉长器，注射时需有固定管尖位置的微量操作器。这种技术的长处为任何DNA在原则上均可传入任何种类细胞内。此法已成功运用于包括小鼠、鱼、大鼠、兔子及许多大型家畜，如牛、羊、猪等基因转殖动物。

       目前最常用来生产转基因动物的方式为：直接把重组过的 DNA 注入授精卵的原核(pronuleus) 中，将从胚胎提供者的输卵管中取得的授精卵移到倒置显微镜上的微量注射台上，然后利用固定吸量管 (holdingpipette) 固定住，之后注射针则依序穿过 zona pellucida，ocyte membrane 及malepronuleus membrane后，将 DNA注入，注入时可以见到原核膨大。以小鼠受精卵雄原核的显微注射为例，显微注射所使用的受精卵固定吸管（holdingpipette）及注射针（injectionneedle）制备很困难，除影响操作时间外，也是影响转基因效率及基因注入后之胚胎存活及转基因成功与否极其重要的因子。固定吸管之内、外径分别为30、80μm是较为合适的，显微注射针自针尖起20μm处的外径为4μm时，可获得良好的转染效率。固定吸管的内径如果太小，会导致吸力不足，对受精卵操控不易；如太大，则受精卵易受伤害，影响胚胎的存活率。显微注射针尖如果太粗，则导致插入透明带及原核的阻力增加，且DNA流量过多，受精卵易于裂解；太细则导致针内DNA流出速率过慢，且易阻塞，而使DNA无法顺利流入原核内，影响注射效率。因此进行受精卵雄原核的显微注射时，如何制备适用固定受精卵的吸管及显微注射针是关乎转基因效率极其重要的因素。